Primer5入門級引物設計攻略

Primer5是分子生物學常用的引物設計軟件，準確率高，操作性強，下面小編就如何利用Primer5進行引物設計分享自己的心得，本篇較簡單，適合初學者。

操作方法

（01）獲取引物模板引物與模板一一對應，設計引物之前先要找到一段匹配的模板。以H9禽流感病毒HA基因為例，在NCBI上下載一個最新的病毒HA基因作為本經驗所介紹的引物設計的模板。

（02）新建打開Primer5（小編的版本為英文版），依次點擊“file”——“new”——“DNA Sequence”，新建操作界面。

（03）輸入模板基因複製基因模板後，使用鍵盤快捷鍵“Ctrl+V”將下載的引物模板粘貼到空白框內，然後選擇“As is”，點擊“OK”。

（04）Search Primer找到界面左上角“Function”——“ Primer”，在新跳出的界面上點擊“Search”，需要設置相應的條件，才能開始搜索。

（05）條件設置點擊“Search”後，又跳出一個界面，我們從上到下依次設置：“Search For”選擇“PCR Primers”；“Search Type”選擇“Pairs”；“Search Ranges”要根據不同的情況而定，一般來説選擇基因全長，如“1”——“1683”；“PCR Product Size”一般鑑定選擇300-500，測序選擇1200-1600，不能超過基因全長；“Primer Length”一般為20+(-)2。

（06）點擊兩次“OK”條件設置完畢後，點擊“OK”，跳出新的界面後再點擊“OK”，最後跳出軟件為你選擇的按照合成率從高到底的全部引物序列。

（07）引物選擇將引物表與左側表格結合起來進行引物的選擇。從小編設計的引物表中看到，最高合成率為88，其對應的左側表中均出現“Dimer”和“Cross Dimer”，説明此引物不甚理想。最佳的情況為“Hairpin”、“Dimer”、“False Priming”和“Cross Dimer”都不出現，也就是100合成率。

（08）重新設置條件如何引物不甚理想，那麼就需要重新設置引物的各個條件，尤其是“Search Ranges”的選擇，需要我們再次點擊“Search ”，跳出條件設置界面後重新設置。

（09）選擇理想引物經過多次的不斷更改和設置後，最終選出較為理想的一對引物，合成率最好在98以上，四種狀況均不出現為好。