NCBI中primer-blast使用方法

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這個工具整合了目前流行的Primer3軟件，再加上NCBI的 Blast進行引物特異性的驗證。Primer-BLAST免除了用另一個站點或工具設計引物的步驟，設計好的引物程序直接用Blast進行引物特異性驗證。並且，Primer-BLAST能設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：沒辦法準確的翻譯，只好作罷，汗！）。Primer-BLAST有許多改進的功能，這樣在選擇引物方面比單個的用 Primer3和NCBI BLAST更加準確。

操作方法

（01）Primer-BLAST的輸入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三個部分：target template（模板區）, the primers（引物區）, 和specificity check（特異性驗證區）。跟其它的BLAST一樣，點擊底部的“Advanced parameters”有更多的參數設置。

（02）模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，輸入目標模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在這裏輸入了序列，是用於引物的設計。Primer-BLAST就會根據你輸入的序列設計特異性引物，並且在目標數據庫（在specificity check區選擇）是唯一的。

（03）引物（Primers）如果你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞。可以在Primer Parameters區填入你的一條或一對引物。並且選擇好驗證的目標數據庫（在specificity check區選擇）。根據需要可設置產物的大小，Tm值等。

（04）特異性（Specificity）在specificity check區，選擇設計引物或驗證引物時的目標數據庫和物種。這一步是比較重要的。這裏提供了4種數據庫：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前兩個數據庫是經過專家註釋的數據，這樣可以給出更準確的結果。特別是，當你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數據庫

（05）作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。selected reference assemblies 包括以下的物種： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr數據庫覆蓋NCBI所有的物種。